Контроль якості МСК: критерії відбору донорів, генетична стабільність та проліферативний потенціал клітин

У сучасній регенеративній медицині мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) представляють революційний напрямок та служать потужним інструментом терапії. Вони надають нові можливості для лікування травм, дегенеративних захворювань та аутоімунних розладів.

У сучасній регенеративній медицині мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) представляють революційний напрямок та служать потужним інструментом терапії. Вони надають нові можливості для лікування травм, дегенеративних захворювань та аутоімунних розладів. Але ефективність клітинної терапії залежить від якості донорського матеріалу та точного дотримання суворих міжнародних стандартів виробництва, які включають: 

• фенотипову та функціональну характеристику клітин;
• молекулярні маркери мультипотентності;
• контроль стерильності, безпеки та генетичної стабільності.

Міжнародне товариство клітинної терапії (ISCT, International Society for Cell & Gene Therapy) у своїх рекомендаціях встановило мінімальні критерії для стандартизації визначення мезенхімальних стовбурових клітин людини, які включають 4 ключові вимоги:

1. 1. 1. • Адгезивність. МСК повинні прикріплюватись до поверхні культурального посуду, що дає можливість культивувати та досліджувати клітини під час їх розвитку в лабораторних умовах.
         • Ідентичність. Однозначно ідентифікувати МСК-популяцію допоможуть наступні характеристики:

• експресія позитивних маркерів (CD90, CD73, CD105) на поверхні клітин;
• відсутність гемопоетичних маркерів (CD45, CD34), маркерів моноцитів та макрофагів (CD14 або CD11b), В-клітинних маркерів (CD19 або CD79a) та HLA-DR.

1. 1. 1. • Здатність до мультипотентної диференціації. МСК повинні бути здатними трансформуватися in vitro в кісткові (остеобласти), жирові (адипоцити) та хрящові (хондробласти) клітини.
         • Чистота. Гомогенність популяції, відсутність сторонніх домішок, ендотоксинів, мікоплазм та інших мікробіологічних контамінантів у фінальному продукті.

Багаторівнева селекція донорів – фундамент якості

Якість МСК-популяції визначається на етапі вибору донора. В клініці ReoCell використовується багаторівнева селекція, яка охоплює біологічні та епідеміологічні параметри.

Віковий фактор та його роль у якості клітинної терапії

Для отримання МСК-матеріалу важливо відбирати молодих донорів. Науково доведена пряма кореляція між віком донора та біологічним потенціалом клітин. Молоді клітини мають довші теломери – захисні структури, які розташовані на кінцях хромосом. З кожним діленням клітини ці структури скорочуються. До того ж з віком накопичуються епігенетичні модифікації (метилювання ДНК, ацетилювання гістонів). Тому в ReoCell користуються послугами донорів віком 20–35 років, щоб забезпечити максимальний потенціал регенеративних властивостей.

Для молодих клітин з довгими теломерами характерні:

• висока експресія генів, пов’язаних з мультипотентністю (здатністю клітин диференціюватися в обмежену кількість типів клітин);
• низька базальна експресія прозапальних цитокінів;
• оптимальний епігенетичний профіль;
• високий потенціал проліферації, що сприяє оновленню тканин та регенерації пошкоджень;
• низький ризик реплікативного (клітинного) старіння;
• підвищена функціональна активність;
• висока секреторна активність (виділення факторів росту та екзосом).

Скринінг на гемотрансмісивні інфекції: стандарт безпеки

При відборі донорського матеріалу особливо важливе значення має відсутність патогенів, які передаються через кров. Спеціалісти ReoCell в своїй роботі використовують «золотий стандарт» безпеки – NAT-тестування (Nucleic Acid Testing). Ці методи дозволяють помітити генетичний матеріал вірусів (ВІЛ, гепатити B та C) навіть у період «серологічного вікна» – на 20–100 днів раніше, ніж серологічні аналізи.

У випадку позитивних результатів донори виключаються з програми або піддаються повторному тестуванню через 3–6 місяців.

Валідація генетичної стабільності 

Один із головних страхів пацієнтів при використанні клітинної терапії – ризик мутацій, здатних спричинити малігнізацію.

У ReoCell цей ризик нівелюється завдяки суворому дотриманню всіх критеріїв контролю генетичної цілісності:

• Каріотипування методом G-banding

G-banding – цитогенетичний метод, який дозволяє візуалізувати всі 46 хромосом людини та виключити або підтвердити аномалії. Завдяки цьому аналізу вдається виявити навіть незначні кількісні (анеуплодії) та структурні (транслокації, дуплікації, делеції, інверсії) зміни, які неможливо побачити при звичайному мікроскопічному дослідженні.

Для підвищення чутливості тестів рекомендована комбінована стратегія, при якій G-banding поєднується з молекулярними методами.

Моніторинг ризиків спонтанної трансформації при тривалому культивуванні in vitro.

Тривале вирощування клітин часто призводить до генетичної та епігенетичної нестабільності:

• збільшення кількості клітин зі зміненим каріотипом;
• підвищення ймовірності злоякісної трансформації клітин;
• втрати здатності до проліферації та нормальної регенерації.

Щоб запобігти спонтанним трансформаціям та зберегти стабільний генофонд, в ReoCell регулярно проводять каріотипічний аналіз, контролюють морфологію клітин та зводять до мінімуму кількість пасажів.

Оцінка функціональної спроможності 

Недостатньо підтвердити ідентичність та безпеку клітинного матеріалу, адже клітини повинні бути не просто живими, а й ефективними.

ISCT 2023–2025 наголошує на необхідності комплексної оцінки функціональної спроможності – матриці потенціалу (potency matrix), яка поєднує функціональні та молекулярні тести:

• Кінетика проліферації: розрахунок PDT (Population Doubling Time) та аналіз клітинного циклу

Один із ключових показників якості МСК – швидкість їх розмноження. Для оцінки цього параметру використовують Population Doubling Time (PDT) – час, за який популяція клітин збільшується вдвічі.

Розрахунок PDT виконують за формулою:

PDT = (t × log 2) / (log Nf – log N0), де t – час культивування (в година), Nf – кінцева кількість клітин, N0 – початкова кількість клітин.

PDT молодих МСК – 24-48 годин. Зі збільшенням пасажу PDT зростає до 72-96 годин та більше, що свідчить про накопичення старіння. Тому для клінічного застосування ми використовуємо МСК, PDT яких менше 60 годин.

Визначити розподіл клітин за фазами клітинного циклу (G0/G1, S, G2/M) допоможе проточна цитометрія, при якій вимірюють вміст ДНК.

Здорові молоді МСК повинні мати G0/G1 = 60–75%, S = 15–25%, G2/M = 5–10%. Дисбаланс свідчить про клітинний стрес або патологічні зміни.

• Колонієутворююча здатність (CFU-F assay)

Colony Forming Unit-Fibroblast assay – золотий стандарт оцінки самовідновлення та потенціалу розмноження МСК.

Клітини у низькій концентрації (1–10 клітин/см²) висівають у культуральні посудини. Окремі клітини починають розмножуватися, утворюючи видимі колонії. Кожна колонія походить від однієї стовбурової клітини, що свідчить про її самовідновлюючу здатність.

Здорові молоді МСК (Р1–Р2) дають 35–40% CFU-F (на кожні 100 посіяних клітин колонії утворюють 35–40). До п’ятого пасажу (Р3–Р5) цей показник знижується до 20–30%, а на пізніших пасажах (Р6–Р7) — до 10–20%.

• Мультипотентна диференціація

Основна ознака мультипотентності МСК – здатність диференціюватися в трьох напрямках: остеогенезу, хондрогенезу та адипогенезу (перетворюватися на 3 типи тканин – кісткову, хрящову, жирову).

Для підтвердження остеогенної диференціації МСК культивують у спеціальному остеогенному середовищі, що містить L-аскорбінову кислоту, β-гліцерофосфат та дексаметазон.

Виявити хондрогенну диференціацію допоможе культивація у гіпоксичному середовищі з додаванням TGF-β3.

Адипогенну диференціацію підтверджують шляхом культивації МСК в адипогенному середовищі (інсулін, дексаметазон, IBMX, індометацин).

Технологічні обмеження: поняття “ліміту пасажування” та запобігання репликативному старінню

Кожне вирощування і розділення клітин на нові культури називають пасажем.

Старі клітини характеризуються:

• зменшеною здатністю до диференціації;
• зниженою секреторною активністю;
• підвищеним синтезом прозапальних цитокінів;
• зниженою резистентністю до оксидативного стресу.

З таблиці видно, що оптимальне вікно для клінічного застосування МСК – перші 5-7 пасажів. Тому в клініці ReoCell суворо дотримуються ліміту пасажування – регулярно проводять тестування на маркери старіння та використовують лише клітини «ранніх» пасажів.

Міжнародні стандарти біобанкінгу МСК

Зберігання та управління запасами МСК регулюється міжнародними стандартами: ISO/TS 22859:2022 та ISO 24651:2022.

ISO/TS 22859:2022 – стандарт для роботи з живими клітинами, який встановлює вимоги до:

• маркування та ідентифікації зразків;
• відстежуваності через весь ланцюг виробництва;
• документації та логування подій;
• управління даними та конфіденційністю.

ISO 24651:2022 – стандарт для консервування клітин, який визначає оптимальні методи кріопреціпітації та зберігання МСК:

• використання ДМСО (диметилсульфоксиду) в якості кріопротектанту;
• контрольовані темпи заморожування;
• зберігання при -196°C у рідкому азоті або -80°C у морозильниках;
• протоколи розморожування та віротипування;
• валідацію виживаності після розморожування (≥80% для клінічного застосування).

В ReoCell суворо дотримуються обох стандартів, що забезпечує максимальну стабільність якості при довгостроковому зберіганні.